Extracto
Antecedentes
3'-desoxi 3 '- [
18 F] fluorotimidina (
18F-FLT) es un trazador utilizado para evaluar la proliferación celular
in vivo
. El objetivo del estudio fue utilizar
18F-FLT tomografía por emisión de positrones (PET) para estudiar las respuestas de tratamiento a un nuevo compuesto anti-cáncer. Para ello, hemos realizado un estudio primeros efectos antiproliferativos de la quimioterapia experimental Top216 de forma no invasiva mediante PET.
Metodología /Principales conclusiones
En vivo Red de captación
18F-FLT en xenoinjertos de cáncer de ovario humano en ratones (A2780) se estudió en diversos puntos temporales después del tratamiento Top216 (50 mg /kg iv a las 0 y 48 horas) se inició. exploraciones de línea de base
18F-FLT se hicieron antes de que cualquiera Top216 (n = 7-10) o vehículo (n = 5-7) se inyectó y se repitieron después de 2 y 6 horas y 1 y 5 días de tratamiento. Un estudio paralelo se hizo con 2'-desoxi-2 '- [
18F] fluoro-D-glucosa (
18 F-FDG) (n = 8). la captación del marcador se cuantificó usando pequeño animal PET /CT. resultados de las imágenes fueron validados por los cambios de volumen del tumor y la expresión de genes de Ki67 y TK1. Top216 (50 mg /kg 0 y 48 horas) inhibió el crecimiento del tumor A2780 comparación con el grupo control (P & lt; 0,001).
captación de 18F-FLT disminuyó significativamente a las 2 horas (-52%, p & lt; 0,001), 6 horas (-49%, p = 0,002) y el día 1 (-47%, p & lt; 0,001) después del tratamiento Top216. En el día 5 captación
18F-FLT fue comparable al consumo en el grupo control. La captación de
18F-FLT se mantuvo sin cambios en el grupo control durante el experimento. En el grupo de tratamiento, captación de
18 F-FDG se redujo significativamente a las 6 horas (-21%, p = 0,003), el Día 1 (-29%; p & lt; 0,001) y el día 5 (-19%, p = 0,05) en comparación con el valor basal.
Conclusiones /Importancia
una inyección con Top216 inició un descenso rápido y significativo en la proliferación de células evaluable por
18F-FLT después de 2 horas. Los primeros reducciones en la proliferación de células tumorales precedidos cambios en el tamaño del tumor. Nuestros datos indican que
18F-FLT PET es prometedor para la evaluación no invasiva precoz de los efectos de la quimioterapia, tanto en el desarrollo de fármacos y para la adaptación de la terapia en pacientes
Visto:. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Højgaard L, et al. (2010) Detección temprana de la respuesta a la Experimental quimioterapéutico Top216 con [
18 F] FLT y [
18 F] FDG en el cáncer de ovario humano xenoinjertos en ratones. PLoS ONE 5 (9): e12965. doi: 10.1371 /journal.pone.0012965
Editor: Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Julio, 2010; Aceptado: 28 Agosto 2010; Publicado: 24 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Munk Jensen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AP Moller Fundación, Fundación Nacional de Tecnología avanzada danés, Svend Andersen Fundación, Fundación Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck, Birthe y John Meyer Fundación, Sociedad danesa del cáncer, Fundación para la Investigación Rigshospitalets, Región de la capital de Dinamarca y TopoTarget A /S. Los co-autores empleadas por TopoTarget tenían un papel en el diseño del estudio y la recopilación de datos y análisis. Las otras fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los siguientes coautores tienen conflicto de intereses: Peter Buhl Jensen: participaciones en la propiedad y empleo en TopoTarget a /S. Maxwell Sehested: participaciones en la propiedad y empleo en TopoTarget A /S. Fredrik Björkling: El empleo en TopoTarget A /S. Kamille Dumong Erichsen: El empleo en TopoTarget A /S. Todos los demás autores no tienen ningún conflicto de intereses. Que algunos de los co-autores son empleados de TopoTarget A /S no altera la adhesión de los autores a los PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Para la evaluación del efecto en estudios en animales durante el desarrollo preclínico de nuevos agentes contra el cáncer, la reducción en el volumen del tumor es el criterio más comúnmente utilizado para la eficacia. Sin embargo, el tiempo hasta la reducción del tumor puede ser largo y requiere mediciones de volumen del tumor repite varias veces a la semana para mostrar el efecto. imagen molecular no invasiva como la tomografía por emisión de positrones (PET) permite procesos biológicos para visualizar y cuantificar de forma no invasiva con el tiempo. Un método no invasivo para detectar la respuesta biológica temprana después del tratamiento contra el cáncer sería valioso en el desarrollo de fármacos contra el cáncer de distinguir efectiva de las drogas no efectivas antes de cambios en el volumen del tumor se hacen evidentes.
El aumento de la proliferación celular es uno de los principales características de cáncer [1]. Mucha investigación se centra en la visualización no invasiva de la proliferación celular, que podría ser utilizado para definir una respuesta biológica al tratamiento temprano en el curso de la terapia. 3'-desoxi-3 '- [
18F] fluorotimidina (
18F-FLT) se usa como un trazador PET para la visualización de la proliferación celular [2].
18F-FLT es un análogo de timidina y por consiguiente un sustrato de la ruta de síntesis de ADN [3]. Cuando se toma en células
18F-FLT es fosforilado por la timidina quinasa-1 (TK1), lo que lleva al atrapamiento intracelular. actividad TK1 está estrechamente regulada del ciclo celular y se expresa principalmente durante la fase S del ciclo celular; En consecuencia, se supone para reflejar la cantidad de células proliferantes [4], [5]. captación
18F-FLT se correlaciona positivamente con el crecimiento celular y la actividad de TK1 [5] - [7]. Varios estudios han mostrado una correlación entre
proliferación 18F-FLT absorción y tumor de células tanto en xenoinjertos de cáncer en ratones [8] - [11] y muestras de tumores humanos [12] - [14].
Varios Los estudios pre-clínicos han evaluado la proliferación medida por
18F-FLT PET en respuesta a diferentes tratamientos quimioterapéuticos y de radiación en diferentes modelos animales de cáncer [8] - [11], [15] - [19]. Los resultados de estos estudios varían; el primer cambio en
captación de 18F-FLT se encuentra en el intervalo de 24 horas a una semana después del inicio del tratamiento. Sin embargo, no todos los estudios han encontrado una correlación entre la respuesta tumoral y un cambio en
captación de 18F-FLT después del inicio del tratamiento [20], [21]. Al parecer, el marco de tiempo para evaluar los cambios en la proliferación es muy variable en función de los diferentes regímenes de tratamiento.
detección no invasiva precoz de la actividad anti-proliferativa con
18F-FLT PET también podría ser útil en una clínica ajuste para determinar si los pacientes responden al tratamiento convencional y durante la fase I, II y III de los estudios al evaluar las respuestas a nuevos fármacos contra el cáncer. Hoy en día los métodos más utilizados para evaluar las respuestas de tumores clínicamente es con técnicas de imagen anatómicas, como la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN) utilizando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST). Sin embargo, esto a menudo requiere varias semanas o meses antes de una posible respuesta se hace evidente [22], [23]. Recientemente, las directrices para el análisis de respuestas tumorales utilizando PET y 2'-desoxi-2 '- [
18F] fluoro-D-glucosa (
18 F-FDG) han sugerido que indica la necesidad de métodos adicionales para la medición de respuestas tumorales [24]. Los nuevos agentes contra el cáncer son a menudo tumorstatic en lugar de tumoricida y los cambios en el tamaño del tumor puede ser mínimo a pesar del tratamiento eficaz generando así una necesidad de nuevos métodos para la evaluación de la respuesta clínica además de la contracción del volumen del tumor.
18 F-FDG es actualmente el radiotrazador más utilizado para la formación de imágenes en oncología y es muy útil para la detección y caracterización de cánceres. Varios estudios han analizado los cambios en
captación de 18F-FDG después del tratamiento contra el cáncer, pero con resultados variables [25].
18 F-FDG sufre de la limitación de que no puede detectar los efectos en una fase muy temprana y una respuesta inflamatoria después del tratamiento del cáncer pueden hasta cierto punto obscuro la detección de efecto contra el cáncer [26], [27].
Top216 es un derivado más potente y metabólicamente estable del Top001, que fue descubierto por BioImage tener efecto destructor potente y selectivo en líneas celulares de cáncer de mama [28]. Top001 inhibe la vía mTOR de una manera selectiva de las células después de la incubación prolongada (~ 24 horas). La correlación entre la inhibición de mTOR y la línea celular sensibilidad es buena, pero no perfecta.
Top216 inhibe la proteína, el ARN y la síntesis de ADN en líneas celulares sensibles después de 1-2 horas de incubación e induce la apoptosis. La inducción de la apoptosis como se mide por la actividad de la caspasa 3/7 es detectable después de 6 horas en las líneas celulares más sensibles. Top001 Top216 y no inhiben significativamente quinasas (Upstate panel de quinasa) o receptores (panel Cerep) a concentraciones relevantes y en la actualidad aún no se ha identificado el objetivo exacto o modo de acción. Top216 muestra potente
in vivo
eficacia en modelos de xenoinjertos de ratón de cáncer de mama humano, próstata, ovario y cáncer de páncreas, tanto por vía intravenosa cuando se administran y po. Top216 se encuentra actualmente en la seguridad regulatoria y de supervisión de toxicología con el objetivo de mover el compuesto en la clínica.
El objetivo del estudio fue utilizar
18F-FLT PET para estudiar las respuestas a un tratamiento nuevo compuesto anti-cáncer no invasiva. Para ello nos Imaged proliferación celular
in vivo
con
18F-FLT PET en un modelo de tumor de ratón de cáncer humano tras el inicio del tratamiento con Top216. La captación de
18F-FLT fue comparada con la absorción de
18 F-FDG y Ki67 y la expresión génica TK1.
Materiales y Métodos
modelo de tumor
Animal atención y se realizaron todos los procedimientos experimentales bajo la aprobación del Consejo de Protección de los Animales de Dinamarca (2006 /561-1124). NMRI hembra (Naval Medical Research Institute) ratones desnudos (8-11 semanas de edad) fueron adquiridos de Taconic Europa (Lille Skensved, Dinamarca) y se dejó aclimatar durante una semana en las instalaciones de animales antes de iniciar cualquier intervención. Se utilizó la línea celular de carcinoma de ovario humano A2780 (un regalo de R. Ozols, el Fox Chase Cancer Center de Filadelfia, PA, enero de 2004). 10
7 se inyectaron las células en 100 l medio mezclado con 100 l Matrixgel ™ membrana basal para la matriz (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) por vía subcutánea en el flanco izquierdo y derecho, respectivamente, durante la anestesia con una mezcla 01:01 v /v de Hypnorm® (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Bélgica) y Dormicum® (Roche, Basilea, Suiza). La línea celular ha sido probado libre de micoplasma; sin embargo, no ha sido autenticada. Las células fueron cultivadas en RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medio 1640+ GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Biological Industries, Israel) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) en 5% de CO
2 a 37 ° C.
diseño experimental
se siguieron Seis grupos de ratones (n = 5-10 tumores por grupo). El tratamiento se inició en el día 12 a 24 después de la implantación de las células tumorales, cuando los volúmenes tumorales fueron en promedio de 225 mm
3. Los ratones recibieron tratamiento Top216 50 mg /kg i.v. o vehículo (2% de DMSO, 20% de HP-B-CD en solución salina) a las 0 y 48 horas (figura 1). Esta dosis de Top216 estaba en anterior análisis se muestran para inhibir el crecimiento del tumor de xenoinjerto A2780 (datos no mostrados). Antes de iniciar el tratamiento, los ratones fueron escaneados con
18F-FLT o
18 F-FDG con el fin de determinar el nivel básico de la captación del marcador.
18F-FLT o exploraciones
18F-FDG se repitieron a los 6, 30 (día 1) y 126 horas (día 5) después de la inyección del Top216 o vehículo (figura 2) Además, se escaneó un grupo de ratones con
18F-FLT al inicio del estudio y 2 horas después del inicio del tratamiento (Top216 o vehículos). El volumen del tumor fue seguido por CT durante los experimentos [29]. Los volúmenes tumorales se calcularon en relación con el volumen al inicio del estudio.
Se analizó la expresión de Ki67 y TK1
in vitro
en un grupo paralelo de los ratones, que fueron tratados con cualquiera Top216 o vehículo y biopsia antes y a las 6, 30 (día 1) y 126 horas (Día 5) después de la iniciación del tratamiento. Las biopsias se eliminan con una aguja 18G y se colocaron inmediatamente en el ARN Later® (Ambion (Europa) Limited, Cambridgeshire, Reino Unido). Todas las muestras fueron almacenadas a 4 ° C y se retiró al día siguiente RNAlater® y las muestras transferidas a -80 ° C hasta su posterior procesamiento qPCR.
Síntesis de
18F-FLT y
18F-FDG
[18F] FLT se sintetizó usando 3-N-Boc-1- [5-O- (4,4'-dimetoxitritilo) -3-O-nosilo-2-desoxi-BD lyxofuranosyl] timina como precursor y sintetizados en un sintetizador de GE TRACERlab MX. Todos los reactivos y cassettes FLT se adquirieron de ABX (Radeberg, Alemania). La pureza radioquímica se determina después de medir el contenido de fluoruro-18 y otras impurezas radiactivas en la solución FLT medido con TLC y HPLC, respectivamente. El contenido de etanol y acetonitrilo se determinó por análisis GC. El pH se midió con un pH-metro. En preparaciones separadas la estabilidad de las preparaciones se examinó después de 8 horas. HPLC se realizó en un sistema Gilson HPLC (Biolab A /S, Dinamarca) equipado con un Dionex UV-detector (Dionex Denmark A /S, Dinamarca) y un detector de radiactividad en línea. La columna de HPLC era un 5 μ C18 (2) 100A Luna, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Dinamarca). El eluyente fue agua /acetonitrilo 90/10 y una velocidad de flujo de 1 ml /min. detección UV a 267 nm. placas de TLC se obtuvieron de Merck y agua /acetonitrilo 5/95 se utilizó como eluyente. Disolventes residuales se determinaron en un Shimadzu GC 2014 (Holm & amp; Halby, A /S, Dinamarca) equipado con un chromosorb 101, 100-120 de malla, 1/8 columna "x 10", detector FID y gas portador helio. La temperatura de la columna era de 210 ° C. La pureza radioquímica de
18F-FLT era & gt; 98% con una radiactividad específica que oscila entre 150-270 GBq /mol a EOS. El contenido de etanol estaba en el intervalo de 7-8% y la cantidad de acetonitrilo estaba por debajo del límite de detección. El pH era de 7.5 a 7.8. La pureza radioquímica, contenido de etanol y el pH no cambió después de 8 horas de almacenamiento a temperatura ambiente.
18 F-FDG fue adquirido de producciones diarias para el uso clínico (Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca).
microPET y microCT imágenes
Los ratones fueron inyectados iv con 10,0 ± 1,5 (media ± DE) MBq
18 F-FDG o 6,9 ± 2,4 (media ± DE) MBq
18F-FLT. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de cada
18 F-FDG escanear [30]. Una hora después de los ratones de inyección de trazadores fueron anestesiados con 3% de sevoflurano (Abbott Scandinavia AB, Solna, Suecia) se mezcla con 35% de O
2 en N
2 y se fija en una cama en presencia de tres marcadores de referencia que permite la fusión de PET y CT imágenes. Una TEP 20 min fue adquirida mediante un enfoque MicroPET 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EE.UU.). Después de la adquisición de datos, los datos de PET se organizaron en sinogrammes y posteriormente reconstruidas con el algoritmo de reconstrucción máximo a posteriori (MAP). El tamaño de píxel era 0,866 × 0,866 × 0,796 mm y en el campo del centro de vista de la resolución fue de 1,4 mm de ancho completo-en-la mitad del máximo.
Tras la exploración microPET, una exploración microCT fue adquirido con una sistema de Microcat® II (Siemens Medical Solutions). Una tomografía computarizada 7 minutos y 10 segundos se realizó con los ajustes de parámetros: 360 pasos de rotación, voltaje del tubo 60 kV, tubo de corriente de 500 mu, se van a agrupar 4 y tiempo de exposición de 310 ms. El tamaño de píxel era de 0,091 × 0,091 × 0,091 mm.
Imágenes
PET y microCT se fusionaron en el software Inveon (Siemens Medical Solutions). Antes región de fusión de los intereses (ROI) se dibuja en las imágenes de TC manualmente mediante una evaluación cualitativa que cubre todo el tumor y posteriormente la absorción del volumen del tumor y el trazador, evaluados por los valores estándar de captación (SUV) medio y máximo, se generaron mediante la suma de los voxels dentro de la planos tomográficos.
reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
el ARN total fue aislado de las biopsias con el TRI Reagent® siguiendo las instrucciones del fabricante (Molecular Research Center Inc., OH, USA ) y, posteriormente, la integridad del ARN se midió en un 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). ARN de calidad se indica como número de la integridad del ARN (RIN) [31]. La concentración del ARN se determinó por NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.). El ARN total (0,3 g) se invirtió transcrito utilizando el kit AffinityScript ™ QPCR de síntesis de ADNc (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se enfriaron y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso posterior.
La expresión génica se cuantificó en el sistema de PCR en tiempo real Mx3000P® de Stratagene. Ki67 y TK1 se cuantifican cada uno en un dúplex con la proteína de unión a TATA (TBP). Se utilizó el Kit Reactivo Brilliant® QPCR Core (Stratagene). Optimización de ensayos resultó en incremento de 50% en dNTP y Taq polimerasa. Se utilizó una concentración de MgCl de 5,5 mM para todos los experimentos. El siguiente perfil térmico se utilizó en todos los experimentos:. 10 minutos de desnaturalización a 95 ° C seguido de 45 ciclos con desnaturalización durante 30 segundos a 95 ° C y el recocido /alargamiento a 60 ° C durante 1 minuto
relativa se usó la cuantificación por el método comparativo (2
-ΔΔCt) [32]. Las medidas se corrigieron para la eficiencia de la reacción de PCR calculado por curvas de dilución de 5 veces la sustitución de ese modo 2 en la fórmula con (E + 1) [33]. correcciones de eficiencia se hicieron para cada gen en cada ensayo. El tejido de muestras de referencia sirve como calibrador. TBP se utilizó como gen de referencia. Este gen fue probado previamente para ser estable en el tumor en comparación con el tejido normal y posteriormente encontrado que es estable en esta configuración experimental.
Los cebadores y sondas TaqMan doblemente marcadas fueron diseñados utilizando Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA ESTADOS UNIDOS). Los cebadores y las sondas se muestran en la (Tabla 1). Para cada gen se encontró el cebador y la sonda concentración óptima. Todas las muestras se realizaron por triplicado usando uno l de cDNA. Para cada muestra se incluyó un control de la transcripción inversa no-(nort), y en cada placa se incluyó un control sin molde (NTC).
El análisis estadístico
La comparación de tumor Top216 de volumen entre los grupos tratados y de control se calcularon utilizando la prueba t de Student para datos independientes una. Se utilizó la prueba t pareada para las comparaciones intragrupo. Se aplicó la corrección de Bonferroni de los valores de p para comparaciones múltiples. Todos los datos fueron evaluados para estar distribuye normal mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los cálculos se hicieron en SPSS 16.0. Los datos se presentan como media ± SEM y P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto del Top216 en el tamaño del tumor
Top216 (50 mg /kg a 0 y 48 horas) inhibió el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de ovario A2780 humanas en ratones
in vivo
comparación con el grupo control (P & lt; 0,001) (figura 3). Los tamaños de los tumores no tratados aumentaron aproximadamente en un factor 3 durante el estudio y los volúmenes de los tumores tratados se mantuvieron sin cambios.
A) Los efectos de la Top216 sobre el crecimiento de xenoinjertos tumorales A2780. El volumen del tumor se determinó por microCT. Los ratones se trataron con Top216 (50 mg /kg) o vehículo a las 0 y 48 horas. *) P & lt; 0,05, **) P & lt; 0,01 vs. línea de base y
## #) P & lt; 0,001 frente a control. n = 15 tumores por grupo. Cambios B) en el volumen del tumor evaluados por Día relación 5 /línea de base en el grupo de control como una función de la captación de FLT línea de base. n = 7 tumores. R
2 = 0,61, p = 0,04.
18F-FLT y
18 F-FDG captación
captación tumoral de línea de base de
18F- FLT en el modelo de tumor A2780 fue relativamente alto (SUVmean 1,05 ± 0,03), por lo que es fácil diferenciar tumor de los tejidos no tumorales, mientras que para
18 F-FDG sólo se observó una captación tumoral modesto (SUVmean 0,48 ± 0,02). En el grupo control, la línea de base captación
18F-FLT predijo aumento del volumen del tumor de más de 5 días (regresión lineal de SUVmean línea de base frente a la proporción del volumen del tumor Día 5 /línea de base: r
2 = 0,61, p = 0,04) (figura 3). No se observó correlación entre la situación basal
18 F-FDG captación y el aumento del volumen del tumor.
La captación de
18F-FLT evaluada por SUVmean disminuido significativamente de 1,09 ± 0,03 al inicio a 0,53 ± 0,02 (-52 %; P & lt; 0,001) a las 2 horas, a 0,56 ± 0,06 (-49%, p & lt; 0,001) a las 6 horas y a 0,58 ± 0,03 (-47%, p & lt; 0,001) en el día 1 después de la iniciación del tratamiento Top216 (figura 4 5).
a) Las ocho imágenes a la izquierda son representativas imágenes de PET /TC fusionadas coronales de dos ratones escaneados con
18F-FLT al inicio del estudio ya los 6 horas y 1 y 5 días después del inicio del tratamiento . Las imágenes en la parte superior demostración de un ratón tratado con Top216 y las imágenes en la parte inferior muestran un ratón control que recibió vehículo. Las cuatro imágenes en la demostración de la derecha fusionan imágenes PET /CT de dos ratones representativos tratados con Top216 o vehículo y escaneados al inicio del estudio y 2 horas después del inicio del tratamiento. Las flechas apuntan hacia los tumores. B) condensados representativos imágenes coronales de PET /CT de dos ratones escaneados con
18 F-FDG en la línea de base y 6 horas y 1 y 5 días después del inicio del tratamiento. Las imágenes en la parte superior demostración de un ratón tratado con Top216 y las imágenes en la parte inferior muestran un ratón control que recibió vehículo. Las flechas apuntan hacia los tumores.
tratamiento /vehículo Top216 se inició a las 0 horas y se repite a las 48 horas después de la primera inyección. N = 5-10 tumores por grupo. *) P & lt; 0,05, **) P & lt; 0,01, ***) P & lt; 0,001 en comparación con la línea base. Los dos gráficos muestran los datos en la izquierda de los experimentos
18F-FLT y los dos gráficos en la demostración de los datos correctos de los experimentos
18 F-FDG.
Después de 5 días
18F captación -FLT (1,33 ± 0,08) fue comparable a la absorción de la línea de base. SUVmean se mantuvo sin cambios en el grupo de control durante el experimento. valores SUVmax disminuyeron significativamente de 2,01 ± 0,09 al inicio a 0,89 ± 0,05 a 2 horas (-55%; P & lt; 0,001), a 0,94 ± 0,08 en 6 horas (-53%, p = 0,002) y a 0,84 ± 0,03 en el Día 1 (-58%, p & lt; 0,001). SUVmax valores aumentaron a 2,26 ± 0,12 en el día 5 después de la iniciación del tratamiento (13%, p = 0,04). SUVmáx se mantuvo sin cambios en el grupo de control, sin embargo aumentó ligeramente en el día 5 después de la iniciación del tratamiento en comparación con el valor basal (13%, p = 0,03).
La captación de
18 F-FDG evaluada por SUVmean disminución significativa de 0,49 ± 0,03 al inicio a 0,39 ± 0,02 (-21%, p = 0,003) a las 6 horas, a 0,35 ± 0,01 (-29%, p & lt; 0,001) en el Día 1 y 0,40 ± 0,02 (-19%, p = 0,05 ) en el Día 5 (figura 4 + 5). La captación de
18 F-FDG en el grupo control fue significativamente mayor en el Día 5 en comparación con la absorción de la línea de base (27%, p = 0,05). Los valores SUVmax disminuyeron significativamente de 0,92 ± 0,06 al inicio a 0,64 ± 0,04 a 6 horas después de la inyección (-31%; p & lt; 0,001), a 0,53 ± 0,02 en el Día 1 (-42%, p & lt; 0,001) y de 0,66 ± 0,03 en el Día 5 (-29%, p = 0,01). SUVmáx se mantuvo sin cambios en el grupo control durante el experimento.
La expresión de Ki67 y TK1
La expresión del gen de referencia TBP fue constante durante todo el experimento. Las diferencias en los valores Ct entre las muestras normales y muestras Nort fueron 13 (mediana). los números de la integridad del ARN (RIN-valores) fueron 9,1 ± 0,1 (media ± DE) para todas las muestras.
Gene niveles de expresión de Ki67 y TK1 se muestran en la figura 6. En la expresión de Ki67 grupo de tratamiento fue significativamente menor a las 6 horas después de la inyección (-31%, p = 0,01) y el día 1 (-71%; p & lt; 0,001) después de comenzar el tratamiento en comparación con el valor basal. La expresión de Ki67 era 21% aumentó en el día 5 (P = 0,04) en comparación con la línea base. La expresión de Ki67 en el grupo control fue significativamente inferior a las 6 horas (-17%, p = 0,01). En comparación con el valor basal
Los datos se presentan como cambios veces después del tratamiento con Top216 /vehículo con relación a los niveles basales (n = 7 tumores por grupo). tratamiento Top216 se inició a las 0 horas y se repitió a las 48 horas después de la primera inyección. *) P & lt; 0,05, **) P & lt; 0,01, ***) P & lt; 0,001 en comparación con el valor basal
En la expresión grupo de tratamiento de TK1 se redujo significativamente en el Día 1 (-56%. , P & lt; 0,001) en comparación con la línea base. En el día 5 se aumentó la expresión de TK1 (30%, p = 0,013) en comparación con el valor basal. En el grupo de control de la expresión de TK1 se mantuvo sin cambios durante el experimento.
Discusión
Una inyección con Top216 inicia una disminución rápida y significativa en la proliferación celular de 52% evaluable por
18F-FLT PET tan pronto como 2 horas después de la inyección. Esta disminución se prolongó durante al menos 1 día, pero en el día 5 (3 días después de la
tratamiento 2º) la captación de
18F-FLT fue comparable al consumo en el grupo de control lo que sugiere que las células tumorales se habían recuperado su proliferación capacidad. La captación de
18F-FLT en el grupo de control no se modificó durante el experimento validando así el efecto antiproliferativo del Top216. En contraste con la rápida disminución de la
captación de 18F-FLT tras el inicio del tratamiento, una pequeña, pero significativa, disminución de
se observó captación de 18F-FDG a las 6 horas y el día 1 después de la iniciación del tratamiento Top216, y esto disminución duró hasta el día 5. cambios en
captación de 18F-FLT (máx disminución: 52%; 2 h) fueron más pronunciados que los cambios en
captación de 18F-FDG (disminución máx: 29%; Día 1). Sin embargo, al final del experimento,
captación de 18F-FDG se mantuvo por debajo del nivel basal en el grupo Top216, mientras que se incrementó en el grupo control.
La disminución de
18F-FLT la absorción después de la inyección inicial no fue acompañado por una disminución en el volumen del tumor como el volumen de los tumores no cambió durante el curso de la terapia. Esto ilustra que el uso de imágenes no invasivo para evaluar la respuesta del tumor es importante ya que la evaluación de la reducción en el volumen del tumor como criterio de valoración habría generado una conclusión negativa falsa. Efecto anti-volumen de Top216 fue, sin embargo, todavía se ve en comparación con el grupo control. Los cambios en la disponibilidad de trazador, por ejemplo, como consecuencia de las alteraciones de la perfusión del tumor después del tratamiento, podría ser responsable de algunos de los efectos en la disminución de la captación
18F-FLT. Sin embargo, el hecho de que
captación de 18F-FDG no disminuyó la misma manera que
18F-FLT conduce a la suposición de que disminuya en
captación de 18F-FLT no sólo es debido a un cambio en la perfusión del tumor, pero también a un cambio fisiológico en la proliferación de células tumorales. Este fue validado por una disminución similar en la expresión de genes Ki67.
Las mediciones de la captación del trazador en el Día 5 pueden ser interpretados tanto como una medida de la proliferación de células 5 días después de la iniciación del tratamiento y como el estado de la proliferación 3 días después de la segunda inyección de Top216. En consecuencia, una inyección de Top216 inhibió la proliferación en algún lugar entre 1 y 3 días, a partir de entonces las células tumorales recuperan su capacidad de proliferación. Esta información podría ser útil en la planificación de los programas de tratamiento durante las investigaciones preclínicas y en los protocolos clínicos futuros con el fin de encontrar el programa de tratamiento óptimo.
En el día 5 después de la iniciación del tratamiento
18 F-FDG captación fue de 19% menor en comparación con el valor basal, mientras que la captación de
18F-FLT fue comparable a la línea de base. La captación de
18 F-FDG en consecuencia se ven afectados por un tiempo más largo que
captación de 18F-FLT. Esto indica que a pesar de la proliferación de células después de 5 días (3 días después de la nd tratamiento 2
) fue comparable a la línea de base, los efectos biológicos del tratamiento todavía existían y se visualizaron por
18 F-FDG. La captación de
18 F-FDG fue significativamente menor a las 6 horas después del inicio del tratamiento en comparación con la absorción de la línea de base. Sin embargo, la disminución del 21% a partir de una absorción baja ya no se visualiza fácilmente en las imágenes de PET /TC (figura 4).
Nuestros resultados que
18F-FLT fue superior a
18 F-FDG para la evaluación de las respuestas tempranas después del tratamiento contra el cáncer están de acuerdo con otros estudios [8], [11], [21]. Los niveles basales de
captación de 18F-FDG en el modelo de tumor eran bajos y sólo la mitad de los niveles basales de
captación de 18F-FLT que está de acuerdo con los hallazgos de otros [11], [17]. Sin embargo, otros estudios han encontrado una mayor captación
18 F-FDG en varios modelos de xenoinjertos en comparación con captación
18F-FLT [16], [19], [21]. Previamente se ha demostrado que es más difícil de medir la respuesta al tratamiento en los tumores con captación del trazador bajo la línea de base, que está en concordancia con los resultados encontrados en este estudio [11], [21], [34].
Los resultados de otros estudios que utilizan
18F-FLT PET para evaluar primeras respuestas a los tratamientos contra el cáncer han sido muy variables, donde se observó respuesta a un inhibidor de la histona deacetilasa después de 4 días [10], la respuesta al cisplatino se ve después de 1 día [9], la respuesta a la ciclofosfamida y la inhibición de mTOR es evidente después de 2 días [16] y el inhibidor de la quinasa ErbB inició una disminución en
captación de 18F-FLT 2 días después del inicio del tratamiento, mientras que no se observó respuesta a las 6 y 24 horas [11]. Sin embargo la comparación de los estudios es difícil debido a las diferentes pautas de tratamiento y de exploración y modelos tumorales variables. En comparación con otros estudios, encontramos una disminución pronunciada en
captación de 18F-FLT evaluada por el PET y se observó esta disminución mucho más temprano (2 y 6 horas). Queda por determinar si esta respuesta temprana es compuesto específico o simplemente debido a nuestro protocolo de ser el primero en evaluar la respuesta tan pronto después del tratamiento.
Si o no el cambio temprano en
18F-FLT y
18F-FDG puede ser un predictor del resultado clínico es aún son necesarios estudios adicionales desconocidos y que investigan los cambios tempranos y la supervivencia global con el fin de responder a esa pregunta.
la comparación de
captación de 18F-FLT y Ki67 la expresión de genes mostró un cambio similar después del tratamiento con Top216. Sin embargo, los niveles de ARNm de Ki67 no disminuyeron tanto como la captación de iniciar el tratamiento después de 6 horas
18F-FLT. Una posible explicación podría ser que los cambios en la actividad enzimática se producen antes de los cambios en los niveles de mRNA. La correlación entre la expresión génica y la absorción de Ki67
18F-FLT en nuestro estudio está de acuerdo con otros estudios para encontrar una fuerte correlación entre Ki67 a nivel de proteínas y la absorción
18F-FLT [8] - [11]. Se encontró una disminución significativa en
captación de 18F-FLT tan temprano como 2 y 6 horas después del inicio del tratamiento; Sin embargo, a pesar de un
captación significativamente menor 18F-FLT a las 6 horas, una disminución en la expresión del gen TK1 fue evidente en el día 1 después de la iniciación del tratamiento. la actividad enzimática de TK1 está correlacionada positivamente con
captación de 18F-FLT [6], [7] y se ha demostrado que los mecanismos de transcripción pueden participar en la regulación de la actividad de TK1 donde tanto la proteína TK1 y los niveles de mRNA fueron relacionados con una disminución de la
captación de 18F-FLT después del tratamiento con un inhibidor de la histona deacetilasa [10]. Los cambios tempranos en
captación de 18F-FLT sin cambios en los niveles de ARNm de TK1 son probablemente debido a los cambios en los niveles de proteína, proteínas modificaciones posteriores a la traducción o los cambios en los niveles de ATP [7], [10], [35].